استراتژی های اقدام پراش شامل می شود

در میکروسکوپ کانفوکال Nikon A1SI ، چراغ انتشار فلورسانس که وارد ردیاب می شود ، ابتدا از طریق یک سیستم تقویت کننده پراش اختصاصی (DEES به طور خلاصه) منتقل می شود که نور انتشار غیر قطبی ورودی را به دو موج نوری قطبی متعامد (با نام P و S) از هم جدا می کند. beamsplitter. هدف از سیستم DEES افزایش کارایی پراش نور توسط توری های مورد استفاده برای جدا کردن انتشار فلورسانس در طول موجهای مؤلفه است. پس از خروج از پرتگاه ، موج P-Wavefront با استفاده از یک سیستم منشور 90 درجه (به یک موج S-polarized) چرخانده می شود و هر دو پرتو توسط یکی از سه توری قابل تعویض پراکنده می شوند. توری های پراش ، که می توانند دقیقاً برای اطمینان از سطح بالایی از تکرارپذیری کنترل شوند ، دارای وضوح طول موج از نانومتر 2. 5 ، 6 و 10 هستند.

این آموزش با یک توری پراش 2. 5 نانومتر نصب شده در چرخ توری ، و نور غیر قطبی ورودی که از واحد قطبی سازی DEES عبور می کند ، آغاز می شود. نور قطبی شده توسط توری پراکنده شده و توسط آینه های دوقلوی که بر روی هر پرتو به طور مستقل کار می کنند ، به سمت نور 32 کانال هدایت می شود ، اما روی فتوکاتد آشکارساز همگرا می شوند. به طور مستقیم بالاتر از ترسیم شماتیک پیکربندی DEES ، طیف هایی از پروتئین فلورسنت زرد افزایش یافته (EYFP) با وضوح کامل است و همانطور که توسط ابزار در افزایش طول موج دیکته شده توسط توری پراش تشخیص داده می شود. به منظور کارکرد آموزش ، از دکمه ها برای انتخاب یک توری پراش استفاده کنید و تغییرات را در طیف EYFP و پهنای باند تشخیص مشاهده کنید. دکمه بزرگنمایی نمای نزدیک از موجهای موج را که از طریق پرتو و روتاتور قطبی حرکت می کنند ، ایجاد می کند.

همه کاره ترین پیکربندی میکروسکوپ کانفوکال برای تصویربرداری طیفی می تواند با استفاده از یک فوتومولتیپیلر چند کانال برای جمع آوری باند های طول موج با اندازه محدود از انتشار فلورسانس پس از پراکندگی با استفاده از یک توری پراکنده ، سرعت کسب جمع آوری پشته های لامبدا را به طرز چشمگیری افزایش دهد. این استراتژی کسب برای سازهای کانفوکال Nikon C2+ و A1 HD25/A1R HD25 در دسترس است که هر یک از آنها قادر به دستیابی به طیفی با سرعت بالا با تنها یک اسکن واحد هستند. فوتومولتیپیلر چند کانال (که اغلب به عنوان یک نور چندتایی چندگانه گفته می شود) در این ابزارها حاوی یک آرایه خطی از کانال های تشخیص 10 نانومتر شخصی است که به یک واحد واحد ساخته شده است ، که باعث می شود چندین باند انتشار به صورت موازی تصویر شوند ، بنابراین به شدت محدود کننده نمونه های عکس و نورپردازی نوری را محدود می کنند. بشرواحدهای تشخیص طیفی نیکون دارای چندین توری پراش با افزایش نمونه برداری از 2. 5 ، 5 (یا 6) و 10 نانومتر هستند که می توانند به صورت جداگانه در مسیر نوری چرخانده شوند تا پهنای باند طیفی بخش های لامبدا را تنظیم کنند. انتشار پراکنده سپس به کانال های دقیقاً تعریف شده در یک فوتوموپیلر چند جانبه 32 کانال منتقل می شود تا یک تصویر جداگانه از هر کانال تولید کند. پهنای باند کل انتشار فلورسانس توسط افزایش نمونه برداری پراش دیکته می شود: نمونه گیری 2. 5 نانومتر یک پهنای باند 80 نانومتر تولید می کند ، یک رنده 5 نانومتر یک پهنای باند 160 نانومتر تولید می کند ، در حالی که گریت 6-نانومتر تولید یک باند باند 192 نانومتر تولید می کند.، و گریت 10 نانومتر یک باند 320 نانومتر را به دست می آورد. در سازهای نیکون ، ردیاب تصویربرداری طیفی از یک مکانیسم محافظت از لیزر استفاده می کند که نور لیزر را از منبع تحریک از بین می برد ، و می توان برای انتخاب هر یک از پهنای باند زیر نمونه ای ، توری پراش را کج کرد.

شکل 1 - Nikon A1 Advanced Dees و تصحیح فوتومولتیپیلر

از جمله ویژگی های پیشرفته میکروسکوپ های کانفوکال تصویربرداری طیفی با کارایی بالا ، سیستم تقویت پراش اختصاصی منحصر به فرد نیکون (DEES) است که برای از بین بردن مصنوعات قطبی ، کاهش تلفات طول موج در توری طراحی شده و حداکثر میزان انتشار فلورسانس را ضبط می کند. سیستم DEES با عبور از انتشار فلورسانس غیر قطبی از طریق یک عنصر نوری دو قطبی دو قطبی برای تولید دو موجهای مؤلفه به نام P و S که به ترتیب موازی و عمود بر صفحه بروز هستند ، عمل می کند. کارآیی پراش پراش با نور S- قطبی مشاهده می شود ، بنابراین یک روتاتور قطبی سازی در مسیر نور p-polarized قرار می گیرد تا نور پلاریزه شده S ایجاد شود و به طرز چشمگیری باعث بهبود کارایی سیستم توری شود. همانطور که در شکل 1 (a) نشان داده شده است ، راندمان پراش نور p-polarized بالاتر از 90 درصد نسبت به طول موج 450 تا 675 نانومتر است. در مقابل ، راندمان چراغ قطبی S 80 درصد در 450 نانومتر است و تقریباً به صورت خطی به تقریباً 45 درصد در 675 نانومتر کاهش می یابد. بنابراین ، سیستم Nikon Dees می تواند در واحد تشخیص طیفی ، توان عملکرد نور و در نتیجه حساسیت را بهبود بخشد. در مواردی که باید عرض طیفی تنظیم شود ، اسکن نمونه های اضافی قابل انجام است یا می توان کانال های آشکارساز مجاور را ترکیب کرد (با نام Binning) به دو برابر ، سه گانه یا چهار برابر عرض باند تشخیص داده می شود.

اگرچه ابزارهای کانفوکال تصویربرداری طیفی مبتنی بر شکاف قادر به تصویربرداری از طیف های انتشار با وضوح بالا هستند ، اما در مقایسه با میکروسکوپ های مجهز به نورپردازی های چند منظوره نسبتاً کند هستند. حتی آن دسته از سازه هایی که دارای شکاف آینه هستند تا بخشی از پهنای باند را به یک فتومپلوی دوم یا سوم نشان دهند ، هنوز از کمبود سرعت تصویربرداری در بازه های زمانی لازم برای تصویربرداری سلول زنده رنج می برند. در بسیاری از موارد ، اندازه گیری طیف بیش از 200+ نانومتر در یک سیستم مبتنی بر شکاف می تواند چند دقیقه یا بیشتر طول بکشد ، بنابراین تصویربرداری طیفی از نمونه هایی را که در طول دوره تصویربرداری تحت حرکت زمانی قرار می گیرند ، مانع می کند. از جمله ویژگی های پیشرفته ای که عملکرد میکروسکوپ های تصویربرداری طیفی را بهبود می بخشد ، تصحیح حساسیت در میکروسکوپ های مبتنی بر چند کد است (شکل 1 (b) را ببینید). این ابزارها برای دقت طول موج برای هر کانال جداگانه با استفاده از خطوط انتشار و تنظیم درخشندگی بر اساس یک منبع نور قابل ردیابی اصلاح می شوند. علاوه بر این ، انتهای عناصر فیبر نوری و سطوح ردیاب با عوامل ضد انعکاس اختصاصی برای کاهش از دست دادن سیگنال و دستیابی به انتقال نوری بالا پوشش داده می شوند. سرانجام ، فناوری پیشرفته پردازش سیگنال ادغام دوگانه (DISP) برای بهبود راندمان الکتریکی به مدار پردازش تصویر اضافه شده است ، از از بین رفتن سیگنال جلوگیری می کند در حالی که دیجیتایزر داده های پیکسل را پردازش می کند و مجدداً تنظیم می شود. در نتیجه ، سیگنال برای کل زمان ساکن پیکسل کنترل می شود ، و در نتیجه نسبت سیگنال به نویز به طرز چشمگیری بهبود یافته است. در حقیقت ، این فن آوری های ترکیبی تصویربرداری طیفی 32 کانال (512 512 512 پیکسل) را با سرعت 24 فریم در ثانیه امکان پذیر می کنند ، به اندازه کافی سریع برای طیف گسترده ای از برنامه های تصویربرداری سلول زنده.

نویسندگان مشارکت کننده

جفری M. لارسون و استنلی A. شوارتز - Nikon Instruments ، Inc. ، 1300 Walt Whitman Road ، Melville ، New York ، 11747.

تونی ب. گینز ، الکس بی. کوکر ، و مایکل دبلیو دیویدسون - آزمایشگاه ملی میدان مغناطیسی بالا ، 1800 دکتر شرقی پاول دیراک ، دانشگاه ایالتی فلوریدا ، تالاهاسی ، فلوریدا ، 32310.

محصولات مرتبط با نیکون

سیستم های کانفوکال A1 HD25 و A1R HD25

میکروسکوپ کانفوکال که تصاویر را با یک میدان دید 25 میلی متر ضبط می کند ، تقریباً دو برابر اسکنرهای نقطه معمولی.

C2+ سیستم کانفوکال

میکروسکوپ کانفوکال C2+ یک مدل اساسی در خانواده محصولات کانفوکال نیکون است. C2+ به عنوان یک ابزار میکروسکوپ اساسی برای آزمایشگاه طراحی شده و قابلیت های تصویربرداری قدرتمند و قوی را ارائه می دهد.